НАБОР КОМПОНЕНТОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ БРУЦЕЛЛЕЗА СОБАК, ВЫЗЫВАЕМОГО BRUCELLA CANIS, В РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ И ИММУНОДИФФУЗИИ В АГАРОВОМ ГЕЛЕ инструкция по применению

Препарат для диагностики бруцеллеза собак.

R-бруцеллезные антигены для реакции агглютинации (РА) и реакции иммунодиффузии (РИД) взаимодействуют соответственно с бруцеллезными R-агглютининами и R-преципитинами, представленными иммуноглобулинами классов М и G и содержащимися в сыворотке крови собак, инфицированных культурами Вrucella canis, с формированием агглютината и преципитата.

Исследование в РА и РИД сыворотки крови:

• всех племенных собак перед плановой вязкой;
• всех племенных собак с 2-месячного возраста, в течение не более 30 дней перед участием в выставках, продажей, ввозом и вывозом из страны;
• собак, контактировавших с больными бруцеллезом животными;
• собак с нарушением функции органов воспроизводства и опорно-двигательного аппарата;
• сук в случае аборта, рождения мертвого или нежизнеспособного приплода.

Получение сыворотки крови

Кровь по 7-10 мл берут у собак из поверхностных вен (головной предплечья или латеральной подколенной голени) стерильными инъекционными иглами без шприца в сухие стерильные пробирки. Пробирки с кровью нумеруют, составляют их опись и выдерживают при температуре 37-38°С в течение 30 мин или при комнатной температуре в течение 1.5-2 ч. Свернувшуюся кровь отделяют от стенок пробирки стальной спицей и выдерживают при 4-10°С в течение 3-4 ч. Сыворотку крови с эритроцитами сливают в сухие пробирки, выдерживают при 4-10°С в течение 10-12 ч, отстоявшуюся сыворотку сливают в сухие пробирки.

При взятии крови необходимо соблюдать меры, предупреждающие возможную контаминацию бруцеллами объектов внешней среды.

Сыворотку крови исследуют в свежем виде или консервированную из расчета:

• 0.05 мл (1 капля) 5%-ного раствора фенола на 1 мл сыворотки;
• 4% сухой борной кислоты к объему сыворотки.

Не консервированная сыворотка пригодна для исследования в течение 6 сут со дня взятия крови при условии ее хранения при 4-10°С, консервированная - в течение 30 сут, замороженная - в течение 3 сут после однократного оттаивания.

Мутные, проросшие и гемолизированные сыворотки исследованию не подлежат.

Постановка реакции агглютинации

Реакцию ставят в объеме 1.0 мл. Сыворотку крови собак исследуют в разведениях 1:50, 1:100, 1:200 и 1:400 (конечные разведения после внесения антигена). Исходное разведение 1:25 готовят путем внесения 0.05 мл сыворотки в пробирки с 1.2 мл 0.5%-ного фенолизированного физиологического раствора (или 0.1 мл сыворотки + 2.4 мл физиологического раствора). Одновременно с испытуемыми сыворотками готовят аналогичные разведения R-бруцеллезной и негативной сыворотки. Для приготовления разведений сыворотки крови в пробирки третьего, четвертого и пятого рядов вносят по 0.5 мл фенолизированного физиологического раствора. Из пробирок первого ряда по 0.5 мл сыворотки в разведении 1:25 переносят в пробирки второго и третьего ряда. После пипетирования по 0.5 мл сыворотки в разведении 1:50 из пробирок третьего ряда переносят в пробирки 4 ряда, после выполнения аналогичной операции по 0.5 мл сыворотки в разведении 1:100 из пробирок четвертого ряда переносят в пробирки 5 ряда. После пипетирования по 0.5 мл сыворотки из пробирок 5 ряда удаляют.

Антиген в рабочем разведении 1:10 в 0.5%-ном фенолизированном физиологическом растворе вносят во все пробирки с приготовленными разведениями сыворотки, за исключением пробирок первого ряда.

В отдельную пробирку вносят 0.5 мл физиологического раствора и 0.5 мл антигена в рабочем разведении (контроль антигена на спонтанную агглютинацию).

Штативы с пробирками встряхивают для смешивания компонентов реакции и помещают в термостат при температуре 37-38°С на 16-18 ч, затем выдерживают при комнатной температуре 1 ч и проводят учет реакции.

Допускается постановка реакции в двух разведениях 1:50 и 1:100. При получении положительного результата в РА, проводят исследование таких сывороток в четырех разведениях 1:50,1:100,1:200 и 1:400. Одновременно в таких же разведениях ставят контроль с негативной и R-бруцеллезной сыворотками для РА, а также контроль антигена.

Учет реакции

Результаты реакции агглютинации в каждой пробирке учитывают визуально, определяя степень просветления жидкости, внешний вид агглютината (при его наличии) или антигена на дне пробирки и во взвеси после встряхивания пробирки. Следует учитывать, что агглютинат, сформировавшийся при взаимодействии R-бруцеллезного антигена с гомологичными антителами контрольной бруцеллезной сыворотки или сыворотки крови больного животного, легко разбивается при резком встряхивании пробирки с компонентами реакции. Поэтому, при учете результатов реакции в руку одновременно берут 2-4 пробирки и, слегка, постукивая по каждой из них пальцем другой руки, в области дна, поднимают агглютинат.

Реакцию оценивают в крестах:

++++ (4 креста) - полное просветление жидкости при наличии хорошо выраженного осадка в виде "зонтика" на дне пробирки. При легком встряхивании "зонтик" разбивается на крупные хлопья, жидкость остается прозрачной, 100%-ная агглютинация антигена;

+++ (3 креста) - полное просветление жидкости, "зонтик" на дне пробирки хорошо выражен. При встряхивании осадок разбивается на мелкие хлопья, жидкость слегка опалесцирует, 75%-ная агглютинация антигена;

++ (2 креста) - частичное просветление жидкости, "зонтик" выражен. При легком встряхивании "зонтик" разбивается на мелкие хлопья, со дна пробирки поднимается небольшое количество не связавшегося антигена. Жидкость опалесцирует, 50%-ная агглютинация антигена.

+ (1 крест) - частичное просветление жидкости, осадок в виде "зонтика" слабо выражен; при встряхивании жидкость остается мутной с небольшим количеством мелких хлопьев, 25%-ная агглютинация антигена;

- (минус) - отсутствие или частичное просветление жидкости. Осадок антигена в виде "зонтика" отсутствует или в небольшом количестве лежит на дне пробирки в виде "пуговицы". При встряхивании - поднимается в виде "косички", легко разбивается, образуя гомогенную взвесь, 0%-ная агглютинация антигена.

Постановка реакции иммунодиффузии

Подготовка компонентов

Приготовление 0.85%-ного раствора хлорида натрия.

Навеску хлорида натрия растворяют в необходимом количестве дистиллированной воды (например, 0.85 г хлорида натрия растворяют в 100 мл).

Приготовление 0.8%-ного раствора агара.

Навеску агара переносят в колбу с 0.85%-ным раствором хлорида натрия и помещают в кипящую водяную баню (например, 0.8 г агара вносят в колбу с 100 мл физиологического раствора). Расплавленный агар фильтруют через вату и разливают в чашки Петри, помещенные на горизонтальную поверхность. В полистироловые для однократного применения чашки Петри диаметром 40 мм вносят по 3.0-3.5 мл, в аналогичные или стеклянные чашки Петри диаметром 90 мм - 20-25 мл. После затвердения геля, в нем с помощью штампа, которым комплектуется "Тест-система для диагностики бруцеллеза крупного и мелкого рогатого скота и северных оленей в РИД с О-ПС антигеном" (ООО НПЦ «Ветбиотест») или идентичного, пробивают лунки: центральную - диаметром 3 мм и 6 лунок по окружности - диаметром 5 мм. Агаровый гель из лунок удаляют с помощью препаровальной иглы или вакуумного (водоструйного) насоса.

Оставшийся агар хранят при температуре 2-10°С в течение 14 сут.

Пробы сыворотки крови от собак, предназначенные для исследования в РИД, отбирают, консервируют и хранят тем же способом и в тех же условиях, что для исследования в РА.

Постановка реакции

Для постановки реакции иммунодиффузии используют чашки Петри разного размера. Для исследования до 4 проб - диаметром 40 мм, для исследования 5-40 проб - диаметром 90 мм.

В центральную лунку геля агара вносят 20 мкл антигена, в периферические - по 40 мкл исследуемых проб сыворотки крови.

В каждой чашке ставят контроль антигена с негативной и R-бруцеллезной сывороткой для РИД.

Внутрь крышки каждой чашки вкладывают фильтровальной бумагу, вырезанную по размеру ее наружного диаметра, которую увлажняют 0.5%-ным фенолизированным физиологическим раствором. Чашку плотно прикрывают крышкой и оставляют при 18-24°С.

Учет реакции

Учет результатов реакции проводят визуально в косом проходящем свете с помощью осветителя ОИ-19 или аналогичного через 24 и 48 ч после постановки реакции.

Линия преципитации между лунками с антигеном и исследуемой сывороткой, сформировавшаяся через 24 или 48 ч, свидетельствует о положительной реакции.

Диагностическая оценка результатов исследования

При титре РА не ниже 1:100 с оценкой 2 креста и выше и (или) при положительной РИД собак считают больными бруцеллезом, вызываемым Вrucella canis.

При титре РА 1:50 с оценкой 2 креста и выше и отрицательной РИД собак считают сомнительно реагирующими на бруцеллез и исследуют повторно через 15 и 30 дней в РА и РИД с R-бруцеллезными антигенами.

В случае получения двух подряд сомнительных результатов в РА с интервалом не менее 30 дней при отрицательных результатах тестирования в РИД, заболевание животных бруцеллезом исключают.

При работе с Набором следует соблюдать правила личной гигиены и техники безопасности, предусмотренные при работе с лекарственными средствами для животных.

Компоненты набора во флаконах без маркировки, с трещинами, нарушением укупорки, содержащие посторонние примеси, плесень и не разбивающиеся при встряхивании конгломераты, с истекшим сроком годности, подвергшиеся замораживанию выбраковывают, обеззараживают путем кипячения в течение 15 мин и утилизируют.

Набор следует хранить в сухом, темном, недоступном для детей месте при температуре от 2° до 10°С.

Помогите другим с выбором, оставьте отзыв об НАБОР КОМПОНЕНТОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ БРУЦЕЛЛЕЗА СОБАК, ВЫЗЫВАЕМОГО BRUCELLA CANIS, В РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ И ИММУНОДИФФУЗИИ В АГАРОВОМ ГЕЛЕ