НАБОР ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ КОРОНАВИРУСНОГО ЭНТЕРИТА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА МЕТОДОМ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ инструкция по применению

Набор для диагностики коронавирусного энтерита крупного рогатого скота методом гемагглютинации применяется для обнаружения коронавирусного антигена и антикоронавирусных антител у крупного рогатого скота.

Антиген определяют в пробах фекалий больных, тонкого и толстого отделов кишечника павших с признаками диареи телят.

Обнаружение антител проводят в сыворотках крови коров и телят, молозиве и молоке лактирующих коров.

Принцип метода заключается в способности антигена коронавируса агглютинировать эритроциты белых мышей. Специфическая сыворотка связывает антиген коронавируса, лишая его способности к агглютинации.

• диагностика коронавирусного энтерита крупного рогатого скота.

Подготовка исследований

Для проведения реакций необходимы следующие материалы:

фосфатно-буферный солевой раствор (ФБСР), который готовят по следующей прописи:

раствор А - NaH ₂PO ₄ ×12Н₂О - 53.72 г на 1 л Н₂О

раствор Б - КН₂РО₄ - 20.42 г на 1 л Н₂О

раствор В - NaCl - 8.59 г на 1 л Н₂О

Для приготовления ФБСР с рН 7.2-7.4 смешивают 430 см³ раствора А, 119 см³ раствора Б и 500 см³ раствора В.

Раствор Альсевера используют для консервирования крови и готовят по следующей прописи:

глюкоза - 24.6 г

натрий лимоннокислый - 9.6 г

натрий хлористый - 5.1 г

вода дистиллированная до 1200 см³.

Для приготовления растворов используют реактивы по чистоте не ниже "чистые для анализа" (чда).

Раствор Альсевера разливают по флаконам и стерилизуют в водяной бане по 30-40 мин три дня подряд. К одной части крови добавляют 10 частей консерванта. Консервированная кровь пригодна для получения эритроцитов в течение 10-12 сут со дня ее получения.

0.5-0.8%-ную суспензию эритроцитов мышей готовят следующим образом: кровь от мышей берут в раствор Альсевера путем тотального обескровливания животных. Затем необходимое количество крови центрифугируют в течение 10 мин при 2000 об./мин. Осадок эритроцитов отмывают трижды ФБСР. Из отмытых эритроцитов готовят 0.5-0.8%-ную суспензию.

Для исследования используют жидкую часть фекалий от больных телят и надосадочную жидкость после центрифугирования 50%-ной суспензии фекалий или кишечника на ФБСР. Кусочки кишечника тщательно измельчают ножницами и растирают в фарфоровой ступке до образования однородной кашицеобразной массы. К полученной суспензии кишечника, а также густым фекалиям добавляют равный объем ФБСР, экстрагируют в течение 3-4 ч при температуре 4-5°С и осветляют центрифугированием при 4000 об./мин в течение 20 мин. Надосадочную жидкость сливают в стерильную посуду и используют для исследований.

Испытуемые сыворотки крови получают от переболевших телят и их матерей в количестве 4-5 см³ и используют в нативном виде или консервируют добавлением антибиотиков или мертиолята (1:10000).

Сыворотки крови без консерванта хранят в замороженном состоянии.

Сыворотку молозива и молока получают после обработки их сычужным ферментом, для чего в пробирку с 2-5 см³ молозива или молока на кончике скальпеля добавляют 1-2 кристалла сычужного фермента, пробирки помещают в термостат на 1-2 ч и после этого образовавшуюся сыворотку отделяют центрифугированием в течение 5-7 мин при 2000 об./мин.

Сыворотки крови, молозива и молока, а также контрольную и специфическую сыворотки из набора перед исследованием обрабатывают эритроцитами мышей, для чего к 0.25 см³ сыворотки добавляют 0.25 см³ 10%-ной суспензии эритроцитов, выдерживают до полного оседания эритроцитов и используют в реакции. Таким образом, перед использованием в реакции сыворотки оказываются разведенными 1:2.

Все компоненты набора перед использованием разводят в 1 см³ дистиллированной воды. В последующем все необходимые разведения рабочих растворов готовят на фосфатно-буферном солевом растворе.

Реакции ставят микрометодом в объеме 0.025 см³ (1 капля), используя полистироловые панели с U-образным дном.

Реакции можно ставить и макрометодом (в 0.2 см³) на панелях из плексигласа.

Обнаружение коронавируса в фекалиях

Коронавирусный антиген в фекалиях обнаруживают в реакции гемагглютинации, которая основана на способности коронавируса вызывать агглютинацию эритроцитов мышей. Эта реакция позволяет обнаружить вирус в материале от больных и павших животных.

Реакцию торможения гемагглютинации в данном случае используют для подтверждения специфичности РГА (т.е. подтверждения принадлежности гемагглютининов именно коронавирусу).

Для постановки этой реакции в первый ряд лунок панели вносят по 0.025 см³ отрицательной (контрольной) сыворотки, во второй - по 0.025 см³ специфической антигемагглютинирующей сыворотки, разведенных 1:20 ФБСР. Затем в первые лунки обоих рядов вносят по 0.025 см³ испытуемого антигена из фекалий или кишечника, приготовленных по схеме, описанной выше, перемешивают и делают двукратные разведения, затем ставят на инкубацию на 1 ч. По истечении этого срока во все лунки обоих рядов панели вносят по 0.025 см³ 0.8%-ной суспензии эритроцитов, перемешивают и оставляют на 1 ч.

Реакция считается положительной, если титр гемагглютининов в исследуемом материале составил 1:32 и выше, и специфическая сыворотка тормозит гемагглютинацию в исследуемом материале не менее чем на 4 разведения (в 16 раз), т.е. если титр гемагглютининов в первом ряду с отрицательной сывороткой составил 1:128, то во втором ряду со специфической антигемагглютинирующей сывороткой он должен быть не выше 1:8.

Выявление антител к коронавирусу в сыворотках крови, молозиве и молоке

Для выявления антител в сыворотках крови, молозиве и молоке используют реакцию торможения гемагглютинации (РТГА). основанную на способности специфических антител тормозить гемагглютинирующую активность вируса.

Постановка РТГА включает два этапа: определение рабочей дозы антигена и постановка основного опыта.

Вначале определяют рабочую дозу антигена (4АЕ), для чего проводят титрование антигена в РГА. Для этого во все лунки панели вносят по 0.025 см³ ФБСР и делают двукратные разведения специфического антигена. Затем во все лунки вносят по 0.025 см³ 0.8%-ной суспензии эритроцитов.

Учет реакции проводят после оседания эритроцитов в контрольных лунках, которые содержат по 0.025 см³ ФБСР и 0.8%-ной суспензии эритроцитов. Учет проводят по четырехкрестовой системе. За гемагглютинирующий титр антигена принимают наибольшее его разведение, которое вызывает агглютинацию эритроцитов не менее чем на ++.

Затем показатель титра антигена в РГА деляг на 4. Так, если титр антигена 1:256, то рабочее разведение будет составлять 1:64 (4АЕ).

Перед постановкой основного опыта определяют правильность выбора 4 АЕ.

Для этого в 5 лунок раскапывают по 0.025 см³ ФБСР, а затем титруют рабочую дозу антигена. Таким образом, в первой лунке будет 2 АЕ, во второй - 1 АЕ, в третьей - 0.5 АЕ. После этого в каждую лунку добавляют по 0.025 см³ 0.8%-ной суспензии эритроцитов, панели встряхивают и оставляют при комнатной температуре на 60 мин.

При правильном выборе рабочей дозы (4АЕ) агглютинация должна быть только в первой и второй лунках. Если в третьей лунке оказывается полная или частичная агглютинация, это означает, что выбранная доза антигена содержит больше 4 АЕ и должна быть уменьшена. Если во второй лунке, где должна быть 1 АЕ антигена, агглютинация не полная, то выбранная рабочая доза содержит меньше АЕ в 0.025 см³ и должна быть увеличена.

Уменьшение или увеличение рабочей дозы антигена проводят добавлением соответственно ФБСР или антигена и повторно проверяют.

Для постановки основного опыта в ряд лунок панели разливают по 0.025 см³ ФБСР. В первую лунку вносят 0.025 см³ испытуемой сыворотки и делают двукратные разведения ее до 1:256. После этого во все лунки панели вносят по 0.025 см³ рабочего разведения антигена (4АЕ). После часового контакта сыворотки с антигеном во все лунки добавляют по 0.025 см³ 0.8%-ной суспензии эритроцитов.

Реакцию учитывают через 60 мин. За титр сыворотки принимают наибольшее ее разведение, которое тормозит агглютинацию эритроцитов с коронавирусным антигеном не менее чем на ++.

Контролями реакции служат результаты взаимодействия специфической и контрольной сывороток с коронавирусным антигеном, для чего эти сыворотки титруют как испытуемые.

Сыворотку считают положительной, если ее титр 1:32 и выше.

По окончании работы ампулы (флаконы), инструменты, остатки неизрасходованного материала обеззараживают кипячением в течение 15 минут. Рабочую поверхность стола и руки обрабатывают дезинфицирующим раствором (0.5%-ный раствор хлорамина).

Меры личной профилактики

Лица, участвующие в проведении исследований, должны соблюдать правила общей и личной гигиены, надевать халаты, колпаки. Во время работы запрещается принимать пищу, пить воду и курить. При попадании компонентов диагностикума на открытые участки тела или слизистую оболочку глаз, рта, носа их тщательно промывают водопроводной водой с мылом.

Набор следует хранить в сухом, темном, недоступном для детей месте при температуре 4-8°С. Допускается хранение при любой минусовой температуре.

Разведенные антиген и сыворотки сохраняют активность в течение года при условии хранения их при - 20°С. Разведенные препараты должны храниться в пенициллиновых флаконах под резиновыми пробками.

Помогите другим с выбором, оставьте отзыв об НАБОР ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ КОРОНАВИРУСНОГО ЭНТЕРИТА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА МЕТОДОМ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ